1.母種制作

雞腿蘑菌種主要采用組織分離法得到純菌種。雞腿蘑菌絲在PDA培養基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，加水至1000毫升)上生長良好。在以下加富培養基或麥粒煎汁培養基上菌絲生長得更好。

(1)馬鈴薯200克、葡萄糖20克、硫酸鎂1.5克、磷酸二氫鉀1.5克、磷酸氫二鉀1.5克、維生素B1 10毫克、瓊脂20克，加水至1000毫升。

(2)小麥200克，浸泡10小時，煮30分鐘，濾汁，加葡萄糖20克、蛋白胨3克、硫酸鎂0.5克、磷酸二氫鉀1.0克、維生素B2 10.2克、瓊脂20克，加水至1000毫升。

(3)小麥250克，浸泡10小時，煮30分鐘，濾汁，加馬鈴薯150克、葡萄糖20克、蛋白胨2克、硫酸鎂1.5克、磷酸二氫鉀1.5克、磷酸氫二鉀1.5克、維生素B1 10毫克、瓊脂20克，加水至1000毫升。菌絲最初白色，然后變成灰白色，培養基的顏色也隨之加深。在恒溫箱中，25℃條件下菌絲在7～10天可長滿斜面，最快的5～6天。

2.原種制作

采用稻草、棉籽殼、雜木屑三種原料為主制作培養基和用麥粒制作培養基。試驗證明，雞腿蘑的菌絲在這幾種培養基上都可以正常生長，但在以麥粒和棉籽殼為主的培養基上生長最好。各種原種培養基的配方如下：

(1)稻草培養基：稻草(切段或粉碎)60%、麩皮25%、玉米粉8%、復合肥5%、糖1%、石灰1%；稻草(切段或粉碎)81.5%，麥麩4.5%，玉米粉8%，復合肥5%，石灰1%。

(2)棉籽殼培養基A：棉籽殼90%、麩皮4.5%、玉米粉4.5%、石灰1%。

(3)棉籽殼培養基B：棉籽殼87.5%、麩皮10%、尿素0.5%、石灰2%。

(4)棉籽殼培養基C：棉籽殼78%、麩皮10%、玉米粉5%、復合肥5%、糖1%、石膏1%、維生素B1微量。

(5)木屑培養基雜：木屑75%、麩皮15%、玉米粉8%、糖1%、石膏粉1%、維生素B1 微量。

(6)麥粒培養基：麥粒加水，浸泡10～15小時，加1%石灰粉煮沸30分鐘(至無白心，而皮不破)，稍晾后裝瓶。

以上培養基的含水量均控制在60%～65%，所有培養基均保持自然pH值，按常規方法裝瓶，塞棉塞，常壓或高壓蒸汽滅菌。冷卻后，在無菌箱或無菌室中無菌操作接入母種，置于24～26℃的溫室或溫箱中培養。經30～35天雞腿蘑菌絲就可以長滿全瓶。除固體菌種外，雞腿蘑的原種也可以用液體培養基進行培養，制成液體原種。在各母種培養基配方中取消瓊脂，即可作為液體培養基配方。

雞腿蘑菌種的好壞對子實體的產量影響甚大，應加以注意。菌株不同，菌絲的形態也不完全一樣。有的菌株起初是線狀的，后來逐漸產生氣生菌絲；有的菌株起初是棉絮狀，后來逐漸變成線狀，色澤為白色或灰白色。好的菌種利用培養料的能力強，菌絲生長較快。